微生物细胞、植物细胞与动物细胞在培养上的区别

　　微生物细胞培养，简称微生物培养，包括原核细胞培养(细菌培养)和真核细胞培养(霉菌培养和酵母培养)。这些细胞小、且具有细胞壁，细胞周期非常短，如细菌每20-30min增殖1次。
 

　　植物细胞培养指原生质体培养。未考虑分离出原生质体的植物细胞培养，无论是游离的单细胞或组织块，都称作植物组织培养。
 

　　动物组织细胞培养包括接种单细胞悬液进行的培养、接种组织块进行的培养。传代细胞如细胞株、细胞系，通常采用接种单细胞悬液进行的培养，是动物细胞培养常见的方式。原代细胞是指来源于动物组织的细胞团块，往往包含多种细胞类型，并且细胞与细胞之间的细胞质膜有紧密联系。如果培养时不需分离组织中的细胞，直接用组织块进行的培养就是组织培养。如果需要制备成单细胞悬浮液，再接种培养，则属于一原代细胞培养。
 

　　一、细胞型微生物培养
 

　　细胞型微生物包括原核细胞类微生物和真核细胞类微生物。细菌、放线菌、螺旋体、支原体、衣原体和立克次氏体等一般属于单细胞原核生物，放线菌是菌丝生长，其菌丝由多细胞组成，但每个细胞往往含多套核物质，属于无隔菌丝。酵母一般是单细胞真核生物，霉菌往往是多细胞真核生物。霉菌菌丝多数时候是有隔菌丝，每个细胞一般含1个细胞核或2个以上的细胞核。
 

　　(一)培养目的
 

　　根据培养基物理性状的差异，分为3种类型：①液体培养，用于增菌培养、鉴别培养等目的；②固体培养，这种培养的目的有增菌、分离、鉴别、保藏等；③半固体培养，一般用于鉴别和增菌目的。
 

　　(二)培养形式
 

　　在液体培养类型中，常见发酵管培养、发酵罐培养、摇瓶培养、多孔板培养等形式。在固体培养类型中，培养皿平板、克氏瓶(扁瓶)平板、试管斜面为常见形式。
 

　　(三)培养仪器
 

　　原核细胞培养所用的培养箱是生化培养箱或厌氧培养箱，前者用于好氧菌培养，后者用于厌氧菌培养，厌氧培养需要钢瓶提供食品级氮气。霉菌培养箱用于霉菌培养，能提供较高的相对湿度，气密性也比较高。
 

　　二、植物组织细胞培养
 

　　植物组织培养是指通过无菌操作分离植物体的一部分，即外植体，接种到培养基上，在人工控制的条件下进行培养，使其产生完整植株的过程。植物组织培养主要有原生质体培养、悬浮细胞培养、花药培养、组织培养、器官培养等形式，其中最常见的是愈伤组织培养。
 

　　(一)培养目的
 

　　由于植物细胞具有全能性，植物组织细胞培养的各种类型均可经过诱导分化形成愈伤组织，发育形成新植株。植物组织培养技术不仅用于快速繁殖，而且有着相当广泛的用途。这些应用包括单倍体育种、种质保存、生理学研究和基因转化等。
 

　　(二)培养类型
 

　　1.植物原生质体培养
 

　　植物细胞培养，狭义上仅指植物原生质体培养，广义上包括植物原生质体培养和植物组织培养。
 

　　脱除细胞壁后的植物细胞称为原生质体。植物原生质体培养是将来源于某个植物器官的组织块中的细胞，用纤维素酶或果胶酶等降解细胞壁，离心收集得到单细胞悬液，然后接种培养。其特点是：①比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA;②便于进行细胞融合，形成杂交细胞；③与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。
 

　　2.植物组织培养
 

　　包括茎尖分生组织或愈伤组织培养。其中，诱发产生的愈伤组织，在条件适宜情况下，可培养出再生植株。用于以下目的：①研究植物的生长发育、分化和遗传变异；②进行特定品种的克隆，即无性繁殖；③制取特定植物组织细胞的代谢产物。
 

　　3.悬浮植物细胞培养
 

　　在愈伤组织培养技术基础上发展起来的一种培养技术。适合于进行产业化大规模细胞培养，制取植物代谢产物。
 

　　4.花药培养
 

　　也称单倍体培养。通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到*纯合的植株或品种。
 

　　5.植物器官培养
 

　　植物器官培养是指将植株的胚、花药、子房、根或茎在体外进行的培养。
 

　　(三)培养条件
 

　　人工培养条件，即人工环境，包括：①提供能量来源的光照条件；②保证新陈代谢的温度条件；③提供气一水平衡的湿度条件；④提供生物原料来源的培养基；⑤避免环境微生物污染的无菌环境。人工环境模仿了植物的自然环境，即光照、温度、湿度、土壤和完整植株体内无菌环境。
 

　　光照、温度的选定通常依据所培养植物的生态习性，习惯上采用暗培养与光照培养(8h/d,30001x)相结合交替进行全程的培养，温度控制在25-28℃范围。湿度在组织培养中不需特意地调整，因为培养容器中的相对湿度几乎达到100%，因此，如何控制人工培养环境的重点和难点在于培养基的选择和配制。
 

　　1.培养基
 

　　植物培养基是从无土栽培的营养液发展而来的，在某种意义上可理解为模拟土壤。最初的培养基是马铃薯浸出液，随着植物生理学和生物化学研究的深入，培养基的构成越来越复杂，成分越来越多。
 

　　当琼脂、明胶支持物的发现并且应用到培养基中时，固体培养基随之诞生。固体培养基是组织培养基中常用的一种培养基类型。不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的，大多在5-6.5范围，一般培养基pH控制在5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常1-2个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍，6个大气压时植物组织即无法生存。无论培养目标设计是针对细胞生长还是针对代谢产物的积累，其培养基主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。
 

　　(1)碳源蔗糖或葡萄糖是常用的碳源，果糖比前两者差。其他的碳水化合物不适合作为单一的碳源。通常增加培养基中蔗糖的含量，可增加培养细胞的次生代谢产物量。
 

　　(2)有机氮源通常采用的有机氮源有蛋白质水解物(包括酪蛋白质水解物)、谷氨酰胺或氨基酸混合物。有机氮源对细胞的初级培养的早期生长阶段有利。L-谷氨酰胺可代替或补充某种蛋白质水解物。
 

　　(3)无机盐类大量元素和微量元素通常使用无机盐代替，铁盐通常以鳌合铁的形式出现。对于不同的培养形式，无机盐的最佳浓度是不相同的。通常在培养基中含大量元素的无机盐浓度控制在25mmol/L左右。硝酸盐浓度一般采用25-40mmol/L，虽然硝酸盐可以单独成为无机氮源，但是加入铵盐对细胞生长有利。如果添加一些琥珀酸或其他有机酸，铵盐也能单独成为氮源。培养基中必须添加钾元素，其浓度为20mmol/L。磷、镁、钙和硫等微量元素的浓度在1-3mmol/L之间。
 

　　(4)植物生长激素大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。植物激素在组织培养中具有无可动摇的核心地位，包括五大类，即生长素类、细胞分裂素类、赤霉素、乙烯类和生长抑制素类。在植物组织培养中常用的是生长素和细胞分裂素。分裂素和生长素通常一起使用，促使细胞分裂、生长。生长素在植物细胞和组织培养中可促使根的形成，有效和常用的有吲哚丁酸、吲哚乙酸和萘乙酸，分裂素通常是腺嘌呤衍生物。
 

　　(5)有机酸加入丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且耐受钾盐的能力至少提高到10mmol/L。三羧酸循环中间产物，同样能提高低接种量的细胞和原生质体的生长。
 

　　(6)复合物质通常作为细胞的生长调节剂，如酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和水果汁。目前这些物质已被已知成分的营养物质所替代。在许多例子中还发现，有些抽提液对细胞有毒性。目前仍在广泛使用的是椰子汁，在培养基中浓度是1-15mmol/L。
 

　　2.培养器皿
 

　　培养器皿是强调植物组织细胞培养物的形态，有试管、三角烧瓶、罐头瓶、培养皿、扁身培养瓶、凹面载玻片、L型管和T型管等种类。
 

　　3.培养外环境
 

　　植物组织细胞培养需要光照、温度、湿度等条件，满足此类条件的培养箱是光照培养箱、大型的人工气候箱、人工气候室或植物生物反应器。
 

　　三、动物细胞培养
 

　　(一)培养类型
 

　　1.依据培养细胞来源动物分类
 

　　分为无脊椎动物细胞培养和脊椎动物细胞培养。
 

　　(1)无脊椎动物细胞培养指来源于多孔动物门、腔肠动物门、环节动物门、节肢动物门、软体动物门和棘皮动物门的细胞培养。
 

　　无脊椎动物的细胞培养研究晚于哺乳动物，由于无脊椎动物细胞在形态、结构和功能以及营养需求等方面的特殊性，其细胞培养多数停留在原代培养和有限细胞系水平上。
 

　　节肢动物门可分为3个亚门7个纲，其中的甲壳纲、蛛形纲、多足纲、昆虫纲的种类多，分布广，某些种类可供药用，主要代表有虾、蟹、昆虫。从1961年至今，已建立昆虫细胞系800余株。
 

　　(2)脊椎动物细胞培养这些脊椎动物从低级到高级包括鱼类、两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类。
 

　　脊椎动物细胞培养开展较早，细胞系建立比较完善。哺乳动物细胞培养研究起步早，研究较多，其生物学特性更接近于人体天然产物，是目前生物技术产品研究开发的重点。
 

　　20世纪80年代WHO明确了哺乳动物传代细胞可用于生物制品生产以后，该领域的细胞培养在生物技术药物的研发中获得了长足的发展。据文献报道，已批准上市的生物技术药物中70%是由哺乳动物细胞产生的。
 

　　2.依据细胞生长特性分类
 

　　一般分为贴壁培养和悬浮培养，参考任务三十一。
 

　　3.依据培养目的分类
 

　　原代培养、传代培养、克隆化培养、扩大培养等。详细内容和操作方法参考任务三十三。
 

　　(二)培养条件
 

　　1.培养基
 

　　常用的有含血清培养基和无血清培养基，一般是合成培养基，有各种型别的商品培养基供应，如干粉培养基和液体培养基。含血清培养基通常使用胎牛血清、新生牛血清或小牛血清，一般添加量为5%-20%。
 

　　2.培养器皿
 

　　常用培养器皿包括培养皿、培养方瓶、多孔细胞培养板等种类，具体内容可阅读任务十九和任务二十。
 

　　3.培养仪器
 

　　开放性的培养使用专业的CO2培养箱，为动物细胞的生长提供温度、湿度与pH保证，其中，CO2浓度的恒定对稳定培养液的pH至关重要。
 

　　除常用的CO2培养箱以外，生产中还需要动物细胞生物反应器、细胞工厂或滚瓶机等仪器或大型设备。
 

　　4.镜检仪器
 

　　倒置生物显微镜是*的镜检仪器，用于观察培养物的生长状况，检查是否有微生物污染，初步判断是何种细胞型微生物污染。
 

　　四、微生物细胞、植物细胞与动物细胞在培养上的主要区别
 

　　在生物技术中，人们已经利用细菌、丝状真菌的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质、氨基酸等产物，但是很多有重要价值的生物物质，如毒素、疫苗、干扰素、单克隆抗体、色素、香味物质等，必须借助于动物细胞、植物细胞的大规模培养来制备。
 

　　如果对微生物细胞、植物细胞或动物细胞在培养上的异同点有一定的了解，将帮助学习者更好地掌握动物细胞的基本条件和要求，为哺乳动物细胞培养建立一定的理论基础。