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高通量测序技术（High-throughput Sequencing）是一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，又称下一代测序技术（Next-Generation Sequencing）、二代测序技术，其使得可对一个物种的基因组和转录组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序（Deep Sequencing）。

第二代测序技术的核心思想是边合成边测序（Sequencing By Synthesis），即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。

文库构建：文库构建即为测序片段添加接头。无论是PCR产生的片段还是基因组鸟/枪法打断的片段都具有特异性（PCR中不同样品反向引物插入了特异性的barcode，因此两端也是特异的），两端缺乏必要的引物因此混合DNA/片段不能直接扩增和测序。DNA/片段需要加接头修饰才能进行上机测序，这个过程称为二代测序的文库构建。